基因組編輯技術(shù)是生命科學(xué)領(lǐng)域的顛覆性技術(shù)，為生物學(xué)基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究奠定了堅實的技術(shù)基礎(chǔ)。歷經(jīng)十余年的不斷迭代和迅猛發(fā)展，基因組編輯技術(shù)經(jīng)歷了如下兩個階段：第一階段以CRISPR-Cas9技術(shù)為代表，利用序列特異性核酸酶良好的靶向性和可編程性，在基因組特定位置產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，繼而通過細胞內(nèi)源修復(fù)機制產(chǎn)生隨機、不可控的小片段插入或刪除，達到基因敲除的目的。第二階段包括堿基編輯技術(shù)和引導(dǎo)編輯技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用。堿基編輯技術(shù)能夠在不依賴DNA雙鏈斷裂的情況下實現(xiàn)特定堿基的高效精準替換，而引導(dǎo)編輯更是能夠精準實現(xiàn)堿基的任意形式突變以及小片段DNA的精準插入或刪除，大幅提升了基因組編輯的精準性，極大地拓寬了技術(shù)的應(yīng)用范圍。上述技術(shù)的疊加使得科學(xué)家們能夠高效、快速并準確地實現(xiàn)基因敲除、堿基定向突變及少量核苷酸的插入或刪除等小片段DNA水平的精準操縱。隨著生物領(lǐng)域研究的快速發(fā)展，小片段DNA的編輯已經(jīng)不能滿足研究和應(yīng)用的需要。新的需求正引領(lǐng)基因組編輯技術(shù)突破DNA操縱長度的限制，邁入第三階段：即實現(xiàn)kb級大片段DNA甚至是染色體水平的精準編輯。然而，目前能夠?qū)崿F(xiàn)大片段DNA精準操縱的基因組編輯工具還十分有限，尤其在植物研究領(lǐng)域，相關(guān)工具還未見報道。

　　近日，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞研究組開發(fā)了PrimeRoot (Prime editing-mediated Recombination Of Opportune Targets)技術(shù)，通過系統(tǒng)整合優(yōu)化的引導(dǎo)編輯工具和位點特異性重組酶系統(tǒng)，實現(xiàn)長達11.1 kb的大片段DNA的高效精準定點插入。研究人員首先通過結(jié)合該實驗室開發(fā)的ePPE（Engineered Plant Prime Editor）（Zong et al., Nature Biotechnology, 2022）以及David Liu實驗室研發(fā)的epegRNA（Engineered pegRNA）（Nelson et al., Nature Biotechnology, 2021）在植物細胞內(nèi)建立了dual-ePPE系統(tǒng)，實現(xiàn)了最高效率可達50%以上的短片段DNA的精準定點插入，繼而使用熒光報告系統(tǒng)在水稻原生質(zhì)體中評估了分屬絲氨酸家族和酪氨酸家族的8種位點特異性重組酶的工作效率，最終將dual-ePPE與篩選出的高效的酪氨酸家族位點特異性重組酶Cre相結(jié)合，開發(fā)了能夠?qū)崿F(xiàn)大片段DNA精準插入的PrimeRoot系統(tǒng)。該系統(tǒng)在水稻和玉米中能夠?qū)崿F(xiàn)一步法大片段DNA的精準定點插入，效率可達6%，成功插入的片段長度最長達11.1kb。相比于傳統(tǒng)非精準的非同源末端連接 (Non-homologous end joining, NHEJ) 策略，PrimeRoot插入5kb及以上DNA片段的效率有明顯提升，且插入完全精準可預(yù)測，在編輯效率和精準性上具有顯著優(yōu)勢。

　　該工作中還展示了PrimeRoot介導(dǎo)的大片段DNA精準定點插入的兩個具體應(yīng)用場景：啟動子的原位插入是基因功能研究以及新性狀創(chuàng)制的重要途經(jīng)，研究人員利用PrimeRoot在水稻HPPD基因的5‘UTR區(qū)精準插入了Actin啟動子（1.4kb），成功實現(xiàn)了啟動子序列在功能基因UTR區(qū)域的原位插入；外源功能基因的導(dǎo)入是賦予作物新性狀的主要手段之一，而傳統(tǒng)基于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因方式插入位置隨機且不精準，往往導(dǎo)致內(nèi)源功能基因的破壞或外源插入基因表達水平不穩(wěn)定，使得理想種質(zhì)的篩選過程繁雜冗長，PrimeRoot大片段DNA精準定點插入為解決這一問題提供了全新方案。研究人員首先通過生物信息學(xué)分析預(yù)測出了水稻內(nèi)33個可用于外源基因插入的基因組安全港（Genomic safe harbor, GSH）區(qū)域。全基因組測序分析表明，傳統(tǒng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA插入是完全隨機不精準的，且無33個GSH內(nèi)的插入事件。相比之下，PrimeRoot介導(dǎo)的插入能夠完全精準定點地落入指定的安全港區(qū)域且在全基因組范圍內(nèi)檢測不到可預(yù)測的脫靶事件。在此基礎(chǔ)上，作者使用PrimeRoot將稻瘟病抗性基因pigmR精準插入到預(yù)測的GSH內(nèi)實現(xiàn)了快速抗病育種。最后，為了進一步提高PrimeRoot的效率，作者在水稻中建立了PrimeRoot組分和插入DNA組分的連續(xù)轉(zhuǎn)化體系，該體系下大片段DNA精準插入的效率相較于一次轉(zhuǎn)化提高了2-4倍，插入Actin啟動子（1.4kb）的效率達8.3%，插入pigmR基因表達框（4.9kb）的效率達6.3%。

　　綜上所述，研究人員通過工程化結(jié)合引導(dǎo)編輯器與位點特異性重組酶，開發(fā)了能夠在植物中實現(xiàn)10kb以上大片段DNA高效精準定點插入的PrimeRoot系統(tǒng)，該系統(tǒng)將為基于基因堆疊的植物分子育種和植物合成生物學(xué)研究提供有力的技術(shù)支撐。相關(guān)研究成果于2023年4月24日在線發(fā)表于Nature Biotechnology雜志（DOI:10.1038/s41587-023-01769-w.）。高彩霞研究組博士生孫超、雷源和李帛樹為本文的共同第一作者，高彩霞研究員與北京齊禾生科生物科技有限公司的Kevin Zhao博士為本文共同通訊作者。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)劉俊教授、中科院遺傳發(fā)育所王延鵬研究員參與了該研究。該研究得到國家重點研發(fā)計劃項目、中國科學(xué)院戰(zhàn)略重點項目、中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部和國家自然科學(xué)基金委等的經(jīng)費資助。

　　圖：PrimeRoot編輯器的建立及優(yōu)化

　　a， PrimeRoot編輯器的原理及模式示意圖

　　b， 不同構(gòu)建形式的PrimeRoot在水稻和玉米中的編輯效率

　　c， 連續(xù)轉(zhuǎn)化法介導(dǎo)的高效PrimeRoot示意圖